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上海聯邁生物與您分享單克隆抗體的制備過程

  單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤技術來制備,雜交瘤(hybridoma)抗體技術是在細胞融合技術的基礎上,將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。
 
  單克隆抗體的特點:
  1、多樣性:主要表現在靶抗原的多樣性、抗體結構的多樣性、作用機制的多樣性等方面。
  2、特異性:針對特定的單一抗原表位,它具有高度的特異性,抗腫瘤抗體藥物的研究表明,其特異性主要表現為特異性結合、選擇性殺傷靶細胞、體內靶向性分布以及具有更強的療效。
  3、定向性:抗體藥物可以定向制造,就是根據需要制備具有不同治療作用的抗體藥物?;谶@些特點,我們可以用來制成運送藥物至病害部位,主要是癌細胞,從而達到治療效果。
 
  制備過程:
  1、免疫動物:免疫動物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠產生致敏B淋巴細胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠,按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官,刺激相應B淋巴細胞克隆,使其活化、增殖,并分化成為致敏B淋巴細胞。
  2、細胞融合:采用二氧化碳氣體處死小鼠,無菌操作取出脾臟,在平皿內擠壓研磨,制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合,并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合,形成雜交瘤細胞。
  3、選擇性培養:選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞,一般采用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中,未融合的小鼠骨髓瘤細胞中DNA的從頭合成途徑會被阻止;未融合的骨髓瘤細胞又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶(HGPRT),不能利用補救途徑合成DNA;這樣未融合小鼠骨髓瘤細胞的兩個DNA合成途徑都被阻止,骨髓瘤細胞DNA不能復制而死亡。 未融合的B淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶,但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由于從B淋巴細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶,可以通過補救途徑合成DNA,并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性,因此,雜交瘤細胞能在HAT培養基中存活和增殖。
  4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化:在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞,只有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞,因此,必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法,篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞,并進行克隆擴增。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后,及時進行凍存。
  5、單克隆抗體的大量制備:單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內誘生法和體外培養法。
  a、體內誘生法 取BALB/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周后,腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖,并產生和分泌單克隆抗體。約1-2周,可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可獲得大量單克隆抗體。
  b、體外培養法 將雜交瘤細胞置于培養瓶中進行培養。在培養過程中,雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體,收集培養上清液,離心去除細胞及其碎片,即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限。各種新型培養技術和裝置不斷出現,大大提高了抗體的生產量。

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