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Tth DNA聚合酶

簡要描述:

Tth DNA聚合酶本酶來源于嗜熱菌Thermus thermophilus HB8。在有Mg2+等二價陽離子存在的情況下,具有DNA多聚酶活性。它與Taq酶一樣被廣泛用于PCR反應,但耐熱性比Taq酶高,因此對高GC含量模板的PCR也有較好的效果。本酶基本上沒有3'→5'外切酶活性及5'→3'外切酶活性,所以也可用于雙脫氧法測序。另外,本酶具有RTase 活性,在Mn2+存在的情況下,RTase

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Tth DNA聚合酶

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Tth DNA聚合酶

250U

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本酶來源于嗜熱菌Thermus thermophilus HB8。在有Mg2+等二價陽離子存在的情況下,具有DNA多聚酶活性。它與Taq酶一樣被廣泛用于PCR反應,但耐熱性比Taq酶高,因此對高GC含量模板的PCR也有較好的效果。本酶基本上沒有3'→5'外切酶活性及5'→3'外切酶活性,所以也可用于雙脫氧法測序。另外,本酶具有RTase 活性,在Mn2+存在的情況下,RTase活性會得到強化。利用該特性,可以用來在同一管中進行逆轉錄反應和PCR反應,即一步法RT PCR。(但是,在Mn2+存在時,RT-PCR的準確性不高)此外,本酶與Taq DNA多聚酶一樣,PCR產物可通過T載體進行TA克隆。它具有下列特點:
1. RT-PCR反應的特異性增加:在較高的溫度下進行逆轉錄,增加了引物雜交和延伸的特異性。
2. 二級結構減少:在較高的溫度下進行逆轉錄,減少了由于RNA二級結構引起的問題。
RNA提取法:試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚,其中異硫氰酸胍可裂解細胞,促使核蛋白體的解離,使RNA與蛋白質分離,并將RNA釋放到溶液中。當加入氯時,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA進入水相, 離心后可形成水相層和有機層,這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA,有機層(黃色)主要為DNA和蛋白質。
實驗步驟:
1、RNA的提取;
2、反轉錄合成cDNA;
3、PCR擴增;
4、產物的電泳和結果的測定。
RT-PCR是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在zui條件下進行。
堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離,當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時,變性的質粒DNA又恢復原來的構型,保存在溶液中,而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構,通過離心,染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
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