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E.coli DNA聚合酶 Ι

簡要描述:

E.coli DNA聚合酶 Ι大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymeraseⅠ,DNA polⅠ),1956年由Arthur Kornberg首先發現的DNA聚合酶,又稱Kornber酶。純化的DNA polⅠ由一條多肽鏈組成,約含1000個氨基酸殘基,分子量為109KD。含有一個二硫鍵和一個-SH基。它具有下列特點:
1. 除具有5'→3'DNA聚合酶功能,還具有5'→3'外切酶活性,3'

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E.coli DNA聚合酶 Ι

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E.coli DNA聚合酶 Ι

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大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymeraseⅠ,DNA polⅠ),1956年由Arthur Kornberg首先發現的DNA聚合酶,又稱Kornber酶。純化的DNA polⅠ由一條多肽鏈組成,約含1000個氨基酸殘基,分子量為109KD。含有一個二硫鍵和一個-SH基。它具有下列特點:
1. 除具有5'→3'DNA聚合酶功能,還具有5'→3'外切酶活性,3'→5'外切酶活性,焦磷酸解作用和焦磷酸交換作用。
2. 可應用于切口平移(NiE.coli DNA聚合酶 Ιck-translation)和cDNA第二鏈合成。
3.  本品不含 DNase I,因此切刻平移反應時需額外添加 DNase I。
RNA提取法:試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚,其中異硫氰酸胍可裂解細胞,促使核蛋白體的解離,使RNA與蛋白質分離,并將RNA釋放到溶液中。當加入氯時,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA進入水相,E.coli DNA聚合酶 Ι離心后可形成水相層和有機層,這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA,有機層(黃色)主要為DNA和蛋白質。
實驗步驟:
1、RNA的提取;
2、反轉錄合成cDNA;
3、PCR擴增;
4、產物的電泳和結果的測定。
RT-PCR是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在zui條件下進行。
堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離,當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時,變性的質粒DNA又恢復原來的構型,保存在溶液中,而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構,通過離心,染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
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